Методы микробиологической диагностики дифтерии

Методы микробиологической диагностики дифтерии

С целью раннего выявления дифтерии и определения носителей дифтерийной палочки необходимы выделение и идентификация возбудителя, а также определение его способности к токсинообразованию. Материалом для исследования служат дифтеритические плёнки, слизь из носоглотки или отделяемое из подозрительных поражений кожных покровов.

Забор материала на дифтерию проводят двумя стерильными тампонами: один используют для посева, с другого делают мазки и окрашивают их по Граму и Найссеру. Взятый материал следует доставлять в лабораторию не позднее чем через 3 ч.

Бактериоскопия дифтерийной палочки

Окраска по Граму не является специфичной, так как дифтерийные палочки сравнительно плохо воспринимают красители, но позволяет косвенно идентифицировать непатогенные коринебактерии, располагающиеся в виде палисада (параллельно) или в виде китайских иероглифов. Окраска по Найссеру позволяет выявить характерные зёрна Бабеша-Эрнста и отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийной палочки С. pseudodiphtheriticum (С. hofmannii), часто обитающей в носоглотке.

Культивирование дифтерийной палочки

Бактерии дифтерии выделяют посевом на элективные среды с теллуритом (например, Клауберга II или Маклёода), ложнодифтерийная палочка (палочка Хофманна) теллур не восстанавливает (см. рис. 8 на вклейке). Для выделения чистой культуры дифтерии часть подозрительной колонии засевают на скошенный агар (или среду Ру), вторую часть — на твёрдую питательную среду для определения токсигенности и (не обжигая петли) проводят определение цистиназной активности (проба Пизу). При положительном результате наблюдают образование коричневого облачка вокруг линии укола. Чистую культуру идентифицируют на средах Хйсса, пользуясь укороченным пёстрым рядом (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина), что позволяет отличить С. diphtheriae от непатоген пых коринебактерии (рис. 14-3).

Для идентификации биоваров дифтерии используют «длинный» ряд углеводов, включающий крахмал и гликоген. Для полной идентификации можно исследовать способность бактерий расти в анаэробных условиях посевом уколом в столбик 0,5% сахарного агара (растёт только С. diphtheriae).

Определение токсигенности дифтерийной палочки

Определение токсигенности дифтерийной палочки in vivo. Проводят подкожным или внутрикожным заражением 0,5-1,0 мл бактериальной культуры морских свинок массой 250 г. За 24 ч до заражения одно животное иммунизируют дифтерийным антитоксином. При положительном результате неиммунизированные животные погибают в течение 3-5 сут.

Определение токсигенности дифтерийной палочки in vitro. Способность к образованию токсина можно определять заражением куриных эмбрионов или культур клеток с регистрацией последующего цитопатнческого эффекта. Можно использовать твердофазный ИФА с использованием антитоксинов, меченных пероксидазой. Также предложены ПЦР и ДНК-зонды для обнаружения гена tox в бактериальной хромосоме. Однако наибольшее распространение получил тест иммунодиффузии Илека. На среду с пониженным содержанием Fe2+ (для более интенсивного токсинообразования) проводят посев исследуемого изолята и эталонных токсигенного и нетокси-генного штаммов параллельными штрихами. На выросшие колонии накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифтерийным антитоксином. Образующийся токсин и антитоксин диффундируют в агар и в месте встречи образуют линии преципитации, так называемые «усы» или стрелы. На практике используют модификацию метода. Полоску бумаги, пропитанную антитоксином (500 ME в 1 мл), наносят на чашку, а исследуемые культуры засевают бляшками по обе стороны бумажной полоски. Контролем служит заведомо токсигенная культура, также посеянная «бляшкой». В результате встречной диффузии токсина и антитоксина в месте их контакта выпадает линия преципитации, сливающаяся с линией преципитации токсигенного штамма.

Фаготипирование дифтерийной палочки

Для дифференциальной диагностики возбудителей используют набор из 9 кори нефагов. С его помощью можно типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов биовара gravis.

Методы микробиологической диагностики дифтерии

Патогенные коринебактерии (возбудитель дифтерии): систематика, морфология, культуральные и тинкториальные свойства, биохимические особенности, антигенная структура и токсинообразование, патогенез и клиника. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.

Возбудитель дифтерии – Corynebacterium diphtheriae и большая группа близких по морфологическим и биохимическим свойствам микроорганизмов рода коринебактерий называют коринеформными бактериями или дифтероидами.Они представлены грамположительными неподвижными палочками, чаще с утолщениями на концах, напоминающими булаву (coryne – булава). Дифтероиды широко распространены в почве, воздухе, пищевых продуктах (молоке). Среди них можно выделить три экологические группы:

– патогены человека и животных;

Многие виды дифтероидов являются нормальными обитателями кожи, слизистых зева, носоглотки, глаз, дыхательных путей, уретры и половых органов.

Дифтерия – острое инфекционное заболевание преимущественно детского возраста, которое характеризуется интоксикацией организма дифтерийным токсином и характерным фибринозным (дифтеритическим) воспалением в месте локализации возбудителя (phther – пленка).

Морфологические и тинкториальные свойства. C.diphtheriae – тонкие полиморфные палочки с булавовидными концами, часто содержащие волютиновые включения, выявляемые окраской метиленовым синим или по Нейссеру. При последнем палочки окрашены в желто – соломенный цвет, зерна волютина (полиметафосфата) – в темно – коричневый цвет. В культурах палочки находятся под углом друг к другу (особенности деления) , образуя различные фигуры – растопыренных пальцев, V, Y, L и т.д. Имеют микрокапсулу, а также фимбрии, облегчающие адгезию к эпителию слизистых оболочек.

Читать еще:  Какая среда во влагалище

Культуральные свойства. На простых средах коренебактерии дифтерии не растут. Они требуют сред с кровью или сывороткой крови (среды Леффлера, Ру), на которых рост отмечается уже через 10-12 часов, за это время сопутствующая (контаминирующая пробы) микрофлора полностью развиться не успевает.

Наиболее оптимальны теллуритовая среда и теллурит – шоколадный агар Маклеода. Высокие концентрации теллурита калия в этих средах подавляют рост посторонней флоры. Коринебактерии дифтерии восстанавливают теллурит до металлического теллура, что придает их колониям темно – серый или черный цвет.

У этого возбудителя выделяют биотипы – gravis, mitis, intermedius, отличающиеся по морфологии, антигенным и биохимическим свойствам, тяжести заболеваний у человека. Тип gravis чаще вызывает вспышки и более тяжелое течение, для него характерны крупные с неровными краями и радиальной исчерченностью колонии в виде маргаритки (R- формы). Тип mitis вызывает преимущественно легкие спорадические заболевания, образует на плотных средах мелкие гладкие колонии с ровными краями (S- формы). Тип intermedius занимает промежуточное положение, образует на плотных средах переходные по характеристикам RS- формы, однако еще более мелкие. На жидких средах вызывают помутнение сред, образуют крошковидный осадок.

Биохимические свойства. Коринебактерии дифтерии ферментируют глюкозу, мальтозу. Отсутствие активности в отношении сахарозы и мочевины – важный дифференциальный признак среди дифтероидов. Обладают цистеназной активностью (расщепляют цистеин) – проба Пизу.

Антигенная структура. Выделяют О- и К- антигены. Полисахаридные компоненты О- антигенов клеточной стенки обладают межродовыми свойствами, обусловливая неспецифические перекрестные реакции с микобактериями, актиномицетами (нокардиями).

Поверхностные К- антигены – капсульные белки, обладают видовой специфичностью и иммуногенностью. Выделяют 11 серотипов. Серотипы 1-5 и 7 относятся к биовару gravis. Серотипирование культур проводят в РА с диагностическими сыворотками к соответствующим сероварам и полигрупповой агглютинирующей сывороткой.

В серологической диагностике у людей чаще применяют РПГА, более чувствительную, чем РА. В настоящее время применяют также ИФА. Многие штаммы коринебактерий дифтерии (особенно нетоксигенные) обладают спонтанной агглютинабельностью и полиагглютинабельностью.

Факторы патогенности. Токсигенные штаммы возбудителя дифтерии продуцируют сильный экзотоксин (термолабильный высокотоксичный иммуногенный белок). Нетоксигенные штаммы не вызывают заболевания.

Токсин вызывает необратимое блокирование удлинения полипептидной цепи, т.е. любого белкового синтеза. Поражаются в основном определенные системы: симпатико – адреналовая, сердце и кровеносные сосуды, периферические нервы. Отмечаются структурные и функциональные нарушения миокарда, демиелинизация нервных волокон, приводящая к параличам и парезам.

Способность к токсинообразованию проявляют лишь лизогенные штаммы, инфицированные бактериофагом (бета – фагом), несущим ген tox, который кодирует структуру токсина (т.е. несущие гены умеренного профага в своей хромосоме). Фаготипирование применяют для дифференциации штаммов коринебактерий дифтерии.

Эпидемиология. Резервуар – человек (больной, реконвалесцент, бактерионоситель). Основной путь передачи – воздушно – капельный, сезонность – осенне – зимняя. Возбудитель хорошо сохраняется при низких температурах, высушенном состоянии (слюна, слизь, пыль).

Клинико – патогенетические особенности. Возбудитель в месте внедрения вызывает фибринозное воспаление с образованием плотно спаянной с тканями фибринозной пленки. Существенное значение в вызываемой патологии имеет действие экзотоксина (описано в разделе “факторы патогенности” ). По локализации выделяют дифтерию ротоглотки (наиболее часто), дыхательных путей, носа и редкой локализации (глаза, наружные половые органы, кожа, раневая поверхность). Дифтерия зева может быть причиной крупа и асфиксии.

Лабораторная диагностика. Основной метод диагностики – бактериологический. Применяют для выявления больных, бактерионосителей, контактных. Стерильными тампонами берут материал для микроскопии и посевов – слизь из зева и носа, пленки с миндалин и других мест, подозрительных на наличие дифтеритических поражений.

Возбудитель выделяют посевом на элективные теллуритовые среды и кровяной агар. На слизистой оболочке глаза часто выявляют C.xerosis (возможная причина хронических конъюнктивитов), в носоглотке – C.pseudodiphtheriticum (палочка Хофманна), выявляют и другие дифтероиды.

Для дифференциации возбудителя дифтерии от дифтероидов используют такие показатели, как способность восстанавливать теллурит и образовывать темные колонии, пробу Пизу, ферментацию углеводов (глюкоза, мальтоза, сахароза) и мочевины, способность расти в анаэробных условиях (характерно для возбудителя дифтерии).

Обязательным этапом является определение токсигенности культуры. Наиболее распространенные методы – биопробы на морских свинках, реакция преципитации в агаре. Используют также ИФА с антитоксином, генетические зонды и ПЦР для выявления фрагмента А гена tox.

Лечение. Используют антитоксическую противодифтерийную сыворотку, антибиотики и сульфаниламидные препараты.

Постинфекционный иммунитет – стойкий, преимущественно антитоксический. Для количественного определения уровня антитоксического иммунитета ранее применялась проба Шика (внутрикожное введение токсина), сейчас – РПГА с эритроцитарным диагностикумом, получаемым сенсибилизацией эритроцитов дифтерийным анатоксином.

Читать еще:  Прижигание эрозии шейки цена

Профилактика. В основе – массовая иммунизация населения. Используют различные препараты, содержащие дифтерийный анатоксин – АКДС, АДС, АДС- М, АД и АД- М.

Diplom Consult.ru

Возбудитель дифтерии, общая характеристика. Отличия от непатогенных коринебактерий. Механизмы патогенеза. Методы микробиологической и молекулярно-биологической диагностики дифтерии.

Характеристика С. diphtheriae

Полиморфные прямые или слегка изогнутые палочки (0,3-0,8х1,5-8 мкм), иногда с булавовидными концами (от греч. korinе — булава) – зерна волютина. Располагаются в виде буквы «V».

Грамположительные. Имеют микрокапсулу. Неподвижны. Спор не образуют

Факультативные анаэробы. Растут на средах с добавлением сыворотки или крови. Выделяют 4 биовара: gravis, mitis, intermedius, belfanti.

цистиназная активность (проба Пизу) – положительная

уреазная активность (проба Закса) – отрицательная

Для идентификации биовара gravis:

О-антиген-общий с микобактериями и нокардиями

К-антиген– несколько десятков сероваров

Антигенный состав дифтерийной палочки неоднороден и её серологическая классификация не общепринята.

Факторы патогенности C. diphtheriae

Экзотоксин (гистотоксин) – нарушая синтез белка, поражает клетки миокарда, надпочечников, нервных ганглиев

Гликолипид – нарушает фагоцитоз

Отличия от непатогенных коринебактерий.

1) В мазке патогенные располагаются буквой V, если беспорядочно – условно патогенные.

2) По биохимическим признакам:

Патогенные:Глюкоза +, крахмал +-, цистиназа +, уреаза -;

НЕпатогенные:глюкоза -, крахмал – , цистиназа – , уреаза +;

Методы микробиологической диагностики:

а) предварительная микроскопия материала по Леффлеру или Нейсеру. По Леффлеру – голубые с более синими концами, по Нейсеру – желтые с коричневыми окончаниями.

б) посев материала на 2 группы сред: среда без телурита и сывороточный телуритовый агар.

в) быстрая идентификация по сокращенному варианту.

г) проба на токсигенность (их 3): 1) реакция преципитации в агаровом геле; 2) реакция коагглютинации со стафилококковым АТ диагностикумом; 3) нейтрализации у животных.

Дифтерийный токсин и его свойства. Анатоксин. Иммунитет при дифтерии и его характер. Определение напряженности антитоксического иммунитета. Специфическая иммунотерапия и специфическая профилактика.

Основной фактор патогенности (дифтерия – токсикоинфекция)

Полипептид, состоящий из двух фрагментов:

Фрагмент В – рецепторная функция

Фрагмент А – блокирует синтез белка на стадии элонгации (наращивания) полипептидной цепи на рибосомах, действуя на фермент трансферазу

Рецепторы к токсину на клетках миокарда, надпочечниках, почках, нервных ганглиях

Выработка токсина кодируется умеренным ДНК-бактериофагом, имеющим ген toх+, который лизогенизирует бактерию (т.е. токсин вырабатывают только лизогенные бактерии).

Устойчивость C. diphtheriae во внешней среде

Достаточно высока, что позволяет е сохраняться несколько дней на предметах (на игрушках – до 15 дней) и в воде. Хорошо переносит высушивание – в пыли до 5 месяцев

Чувствительна к дезинфектантам.

В очаге болезни обязательна дезинфекция

Источник инфекции →Человек (больной или носитель токсигенного штамма)

Основной механизм передачи→ Аэрозольный (воздушно-капельный)

Дополнительный механизм передачи → Контактный (в том числе и непрямой)

Патогенез и клиника дифтерии

Дифтерия (греч. diphtheria – кожа, пленка) – острая инфекция, характеризующуяся:

В месте проникновения возбудителя (в зеве, гортани, реже – в других органах) образуется фибринозная пленка.

Интоксикация – поражение сердечно-сосудистой, кортикоадреналовой систем и периферических нервов.

В нервной ткани токсин вызывает демиелинизацию нервных волокон и, как результат – развитие парезов и параличей

Иммунитет при дифтерии

Естественный иммунитет. Восприимчивость зависит от уровня антитоксического иммунитета. Наиболее восприимчивы не привитые дети до 5 лет. При снижении уровня антитоксического иммунитета могут болеть взрослые.

Постинфекционный иммунитет стойкий. Основной механизм гуморальный:

антитоксический: IgG и IgM к фрагменту В гистотоксина.

антибактериальный иммунитет малопротективен, носит также и клеточный характер

В довакцинальный период (до 1955 года) дифтерия имели широкое эпидемическое распространение среди детей до 5 лет с летальностью 40-60%. С началом вакцинации заболеваемость и смертность резко снизилась. В РБ с 1990 по 1998 год заболели 1028 человек и 29 умерли. Рост был в 1994 г (230 случаев), 1995г (332 случая). В 1996 году была проведена массовая вакцинация (7 млн.). Это снизило заболеваемость. В 2003 году заболело 6, в 2004 – 15, 2005 – 11.

Этиотропная терапия дифтерии

антитоксическая сыворотка(её введение необходимо начинать как можно раньше, пока токсин не связался с тканью миокарда и нервной системы),

антибиотики (b-лактамные, тетрациклины, хинолоны; носителей санируют эритромицином).

выявление и изоляция больных для лечения

дезинфекция игрушек, которыми пользовались больные дети

Плановое введение анатоксина (в том числе входящего в вакцины АКДС и АДС)

при необходимости сохранения антитоксического иммунитета у взрослых необходима ревакцинация анатоксином каждые 10 лет

Читать еще:  Супер чистотел способ применения

Схема лабораторной диагностики при дифтерии

Материал Метод исследования Результаты
Слизь из зева и носа, пленки, налеты с миндалин Бактериоскопический. Материал берут двумя стерильными ватными тампонами, один используют для приготовления микропрепарата, другой для посева. Мазки окрашивают по Нейсеру и метиленовым синим. Метод имеет ориентировочное зна-чение. Бактериологический. Материал засевают на одну из из элективных сред: сывороточную Клауберга II хинозоловую. На этих средах задерживается рост кокков и др. микрофлоры зева. На второй день из подозрительных колоний делают мазки, окрашивают по Нейссеру и отсевают на скошенный сывороточный агар для выделения чистой культуры. На третий день проводят идентификацию чистой культуры по следующим тестам: 1. Определение токсигенности методом диффузной преципитации в агаре; 2. Определение фермента цистиназы (проба Пизу); 3. Определение уреазной активности – посев в среду с мочевиной и индикатором крезолрот (проба Закса). На этом этапе дают положительный ответ, но исследование продолжают. 4. Посев на углеводы: глюкозу, мальтозу, крахмал, гликоген. Выдача окончательного ответа. Коринебактерии дифтерии располагаются под углом друг к другу в виде буквы «V» зерна волютина находятся по полюсам палочек. При окраске по Нейссеру тело палочки окрашивается в желтый цвет, а зерна волютина в черный цвет. Дифтероиды не имеют зерен волютина, а сами палочки расположены параллельно. На свернутой сыворотке мелкие круглые колонии кремового цвета с уплотнением в центре. На среде Клауберга тип gravis образует крупные с радиальной исчерченностью серого цвета колонии; тип – mitis круглые, выпуклые колонии черного цвета. Исследуемая культура образует линии преципитации в агаре. Расщепляет цистин – по ходу укола почернение среды. Не образует уреазу – среда не изменяет цвет. Дифтероиды выделяют уреазу, среда с мочевиной окрашивается в розовый цвет. Тип gravis расщепляет глюкозу, мальтозу, крахмал и гликоген до кислоты, тип mitis полисахариды не ферментирует.

Определение токсикогенности дифтерийных коринебактерий

Токсигенность определяют методом диффузной преципитации в агаре по Оухтерлони. Для этого на чашку с сывороточным агаром накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную дифтерийной антитоксической сывороткой. Рядом с полоской бумаги засевают выделенную культуру в виде «бляшек». Если культура токсигенна, то через 24-48 часов диффундирующий в питательную среду токсин и антитоксическая сыворотка образуют линии преципитации белого цвета.

Ускоренные методы микробиологической диагностики дифтерии

В качестве ускоренного метода диагностики применяется реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

Препараты для специфической профилактики и терапии

Плановая профилактика проводится дифтерийным анатоксином, который входит в состав вакцины АКДС.

Для экстренной профилактики и лечения используют противодифтерийную антитоксическую сыворотку.

Антибиотики: эритромицин, олеандомицин, тетрациклин.

Вопросы для обсуждения

1. Общая характеристика и классификация коринебактерий.

2. Источник заражения, пути передачи инфекции, патогенез заболевания.

3. Материал для исследования, методы лабораторной диагностики.

4. Бактериологический метод исследования дифтерии.

5. Характеристика экзотоксина и метод определения токсикогенности дифтерийной палочки.

6. Специфическая профилактика и терапия дифтерии.

Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопия демонстрационного препарата дифтерийной палочки в чистой культуре, окрашенного по Нейссеру.

2. Окраска готовых микропрепаратов уксуснокислым метилвиолетом, микроскопия.

3. Изучение бактериологического метода исследования при дифтерии с последующей идентификацией возбудителя:

а) характер роста на сывороточных и теллуритовых средах;

б) определение токсигенности методом диффузной преципитации в агаре по Оухтерлони;

в) реакции на цистиназу (проба Пизу);

г) реакция на уреазу (проба Закса);

д) ферментация моно- и полисахаридов.

4. Изучение препаратов, применяющихся для диагностики, специфической профилактики и лечения дифтерии.

5. Выполненную работу оформить протоколом по следующей схеме, отметить полученные результаты.

Протокол бактериологического исследования материала при дифтерии

Дата Ход исследования Результаты
1 день 1. Посев пленок из зева на сывороточный агар, среду Клауберга, хинозоловый агар.
2 день 2. Изучение подозрительных на дифтерию колоний. 3. Пресев на сывороточный скошенный агар для выделения чистой культуры.
3 день 4. Изучение и идентификация чистой культуры: а) мазок, окраска по Нейссеру; б) изучение токсикогенности; в) изучение цистиназы; г) посев в столбики с глюкозой, мальтозой, сахарозой, крахмалом, гликогеном.
Вывод:

Зарисовать микропрепарат дифтерийной палочки, окрашенной по Нейссеру и уксуснокислым метилвиолетом. Зарисовать на чашке Петри с методом определения токсигенности дифтерийной палочки.

Туберкулез

Туберкулез – инфекционное заболевание человека и животных с наклонностью к хроническому течению, характеризующееся образованием специфических воспалительных изменений (бугорков) с преимущественной локализацией в легких.

Цель занятия: овладеть навыком оценки микробиологической диагностики туберкулеза.

– лабораторную диагностику заболевания.

– интерпретировать результаты лабораторных исследований;

– подобрать препараты для специфической профилактики и терапии туберкулеза.

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector